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蚕病检测中免疫学技术的研究与应用
阅读次数:2988 [2011-11-08]
《蚕桑通报》2011,42(3):1-4
 
蚕病检测中免疫学技术的研究与应用
 
鲁兴萌1,蔡顺风1,邱海洪1,孙文静1,何永强2
1. 浙江大学蚕蜂研究所,浙江杭州 3100292. 浙江出入境检验检疫局技术中心,浙江杭州 310012
 
 要:本文介绍了有关应用免疫学技术对蚕病进行检测的研究。根据已有研究和养蚕业的特点,认为家蚕微粒子病的检测是一项非常值得研究的技术。家蚕微粒子病检测的技术根本是解决基于实际应用条件下的灵敏度和特异性问题。
关键词:蚕病;检测;免疫学技术;灵敏度;特异性
中图分类号:        文献标识码:        文章编号:
 
Researches and Applications of Immunological Technologies on Detecting Silkworm Diseases
 
LU Xing-meng1,CAI Shun-feng1QIU Hai-hong1SUN Wenjing1HE Yong-qiang2
1 Institute of Sericulture & Apiculture, Zhejiang University, Hangzhou 310029 China; 2 Technical Center of Zhejiang Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau, Hangzhou 310012 China
 
Abstract: A review is given on the researches and applications of immunological technologies on detecting silkworm diseases. Based on existing studies and the characteristics of sericulture, we believe it is very meaningful to develop effective technologies to detect pebrine disease. The basic aim is to improve sensitivity and specificity of the detecting technologies to solve practical problems.
key wordssilkworm diseases;detection;immunological technology; sensitivity; specificity
 
病害的检测是医学及兽医学的临床治疗和疾病预防中十分重要的内容,通过检测病原微生物或相关物质尽早确诊致病因素,是及时采取有效措施的前提。蚕病防控中同样存在该类情况,由此许多研究人员对蚕病检测技术开展了大量的研究。蚕病检测技术所针对的检测对象主要为非包涵体的病毒和家蚕微粒子虫(Nosema bombycis,简称Nb)孢子。非包涵体病毒的家蚕浓核病毒(Bombyx mori DensovirusBmDNV)和家蚕病毒性软化病病毒(Bombyx mori Infectious Flacherie VriusBmIFV),由于只有约25 nm大小而无法用光学显微镜进行检测;家蚕微粒子病则由于除Nb孢子外还有多种形态类似孢子的存在而难于用光学显微镜进行鉴别[1]
 


 

资助项目:现代农业产业技术体系建设专项资金资助(CARS-22-ZJ0202);浙江省科技厅重大项目 (项目批准号:2010C12005-2)
作者简介:鲁兴萌(1962-),男,浙江,教授,E-mail:xmlu@zju.edu.cn
 
免疫学技术的快速发展为病害检测新技术的研发和水平的提高,提供了重要的理论与技术基础。在医学及兽医学的临床治疗和疾病预防中,大量基于免疫学技术的检测技术被建立并广泛应用。蚕病检测方面虽然开展了不少的研究,但在我国由于养蚕业的特殊性和技术实用化(熟化)程度等问题,尚未见生产中大规模应用的案例。现将该方面的主要研究进行综述,期望为该领域的技术研发和进步提供有益参考。
 
1 免疫学检测技术的原理简要
免疫学检测技术是利用抗原与相应抗体间可发生特异性结合反应的抗原抗体反应(antigen- antibody reaction)而进行。根据抗原的物理性状、抗体的类型(多克隆抗体与单克隆抗体)及参与反应的介质(电解质和固相载体等)等的不同,免疫学诊断技术分为众多的类型。特别是随着抗体标记技术的发展,免疫学诊断技术的特异性和灵敏度得到明显提高,方法更为丰富。
抗体分为两种类别,其一是将纯化的抗原注射到动物(一般为兔、羊和鼠)体内,刺激动物有机体免疫活性细胞产生抗体,达到一定的效价后,采血和析出含有抗体的血清(抗血清)。该法制备的抗血清是多种免疫球蛋白的混和物,故称之为多克隆抗体(针对多种抗原决定簇。Polyclonal Antibody,简称多抗)。其二是将免疫后小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合,通过细胞培养筛选出针对单一抗原决定簇的抗体分泌细胞株,从而大量生产具有极高特异性的单克隆抗体(Monoclonal Antibody,简称单抗)。用于免疫学诊断技术的抗体制备主要包括抗原的纯化、免疫和抗体提取。不同的免疫学诊断技术对抗体制备的要求也有所不同[2]
多抗和单抗都可以通过各种酶、荧光素和金银胶体等标记技术或其它凝集技术大幅提高检测灵敏度。随着新仪器和材料的出现,以及商品化试剂(标记抗体等)的日益增多,抗体与标记技术的组合日益丰富,操作流程日趋简便。
 
2 基于免疫学技术的研究
2.1 凝集反应技术
凝集反应技术在蚕病检测中的应用研究是较早的一种方法,由于抗原与抗体在液体中很快就可发生肉眼可见(直接或显微镜观察)的沉淀而显得非常简便,可以将待检样本放于载玻片、试管和低浓度琼脂中加入抗体直接进行,但该方法的灵敏度十分有限。
在特异性方面,制备家蚕六角形(HC)和四角形(TC)质型多角体病毒(Bombyx mori Cytoplasmic Polyhedrosis VirusBmCPV)多角体的多抗血清能有效区别2种多角体,及核型多角体病毒(Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis VirusBmNPV)多角体和BmIFV等病毒[3]
在灵敏度方面,乳胶致敏是提高免疫学检测灵敏度的有效途径,用乳胶致敏BmCPVBmDNV多抗血清后的玻片凝集反应检测灵敏度可达0.75μg/mL0.5 μg/mL,比双向免疫扩散(Double Immunodiffusion)高约30[4]
用效价为1:2048的兔多抗(Nb)血清稀释后进行玻片凝集反应和显微镜观察,检测灵敏度仅为8×107孢子/mL,但能区别不同来源的微孢子虫[5]。间接凝集反应和协同凝集反应虽然在检测Nb孢子中可以提高灵敏度,但也十分有限(1.1×107孢子/mL[6-7]。但利用单抗技术制备乳胶致敏后的玻片凝集反应,在鉴别不同种类微孢子虫中具有良好的效果[8],日本在上世纪90年代时曾作为蚕种检疫复检技术应用。
2.2 免疫扩散技术
早期利用免疫学技术研究检测家蚕致病性非包涵体病毒技术时,主要采用的方法就是免疫扩散反应。免疫扩散是利用抗原和抗体在具有较大孔径的惰性载体(琼脂糖等)中相互扩散、相遇并发生特异性结合反应而形成肉眼可见的沉淀带,由此进行检测。由于该类方法的简便而在流行病调查等精度要求并不高的工作中应用[9]。具体方法有单向免疫扩散(Single Immunodiffusion)、双向免疫扩散、对流免疫扩散(Reversed Immunodiffusion)和免疫电泳(Immunoelectrophoresis)等。
高速离心纯化BmIFV(坂城株)制备兔多抗后采用双向免疫扩散可以从感染后5-7d病蚕的完全弗氏佐剂(complete Freund´s adjuvant)等量混合液中检出阳性样本,采用双向免疫扩散作为一种操作方便的技术被较多的试验所验证[10-12]。对流免疫扩散和免疫电泳因通过电场对抗原和抗体的作用,加快了免疫反应的发生或检测速度的提高。通过蛋白质的染色可以提高观察灵敏度。该类技术可以在家蚕感染BmDNV病毒后16h,从中肠检测到阳性反应[13]。利用酶标抗体在结果观察方面可以更为容易,在同比条件下灵敏度高于普通对流免疫扩散(可以在家蚕感染BmDNV病毒后16h,从中肠被检测到阳性反应,后者为21h[14]
该类技术主要用于可溶性蛋白或较小颗粒的BmDNVBmFV(约25 nm的检测[1],由于病毒的精确计量较为困难,早期不同试验研究结果的可比性较差,灵敏度的界限不太清晰。Nb孢子由于颗粒相对较大(2.9~4.1 μm×1.7~2.1 μm)而不宜使用该类技术。
2.3荧光标记技术
荧光免疫检测技术是将某些荧光素通过化学方法与特异性抗体结合制成荧光抗体,该抗体与被检抗原发生特异性结合,形成的免疫复合物在一定波长的激发下可产生荧光,可借助荧光显微镜检测或定位被检抗原。
将针对BmCPV的多抗血清制成荧光抗体后用于玻片检测BmCPV的灵敏度可达到2×10-8 mg/mL,较普通玻片法和试管内扩散凝集法的灵敏度(5×10-3 mg/mL6×10-4 mg/mL)更高[15]。分别用纯化家蚕Nb孢子、同属的M11M12的孢子,以及具褶孢虫属(Pleistophora)的孢子为抗原制备的抗血清,采用间接荧光抗体法检测不同孢子的试验表明:4种抗血清可以对不同的孢子进行相互间的鉴别[16]
2.4酶联免疫吸附技术
酶联免疫吸附(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,简称ELISA)是利用免疫反应的高度特异性和酶促反应的高度敏感性,进行定性和定量检测的综合性技术。ELISA具有微量、特异、高效、经济、方便和安全等特点,在诸多行业的检测领域广泛应用。
采用简单的抗体酶标记显色反应即可较对流免疫电泳法的灵敏度高约8[17]。采用纯化多抗的直接法ELISA检测BmIFV的同时,比较其它检测技术的灵敏度(病毒μg/mL)结果表明:ELISA0.003远远高于胶乳凝集反应、双扩散试验和沉淀试验的检测灵敏度(分别为:0.5518[18]ShimizuArakawa的研究获得了相近的灵敏度数据[4]点免疫结合测定法(Dot Immunobinding Assay,简称DIBA)比ELISA更为简便,以制备多抗血清的稀释度对BmDNV的检测灵敏度的测定最高效价为1:32768,对BmDNV的检测灵敏度高于对流免疫电泳和双向扩散试验1000倍,但1:2046抗血清对健康家蚕中肠匀浆的100倍稀释液依然有假阳性[19]
单抗在特异性或解决假阳性方面明显优于多抗,采用单抗进行ELISA的间接法、直接法(腹水)和双抗夹心法检测Nb孢子的灵敏度分别为:1.8×103孢子/mL4×104孢子/mL3.125×105孢子/mL,这些方法在鉴别孢子种类方面具有良好的特异性[20-23]
2.5 免疫金/银染色技术
免疫金/银染色技术(Immunoglod Silver Staining,简称IGSS)是利用胶体金对蛋白质有很强的吸附功能,抗体等高分子被吸附到胶体金颗粒表面后,金颗粒可催化银离子还原成金属银,通过银颗粒的沉积,抗原抗体反应的阳性部位出现在显微镜下可见黑褐色颗粒或肉眼可见红色或粉红色斑点。也是一类放大抗原抗体反应结果的技术。采用IGSS技术光镜观察的方法对Nb孢子检测的研究表明:该技术可以检测1×105孢子/mL,而其它5种微孢子虫呈阴性[24]
上述研究为主要的免疫学技术应用于家蚕病害检测的研究,免疫组织化学技术在鉴别病害种类方面还可利用有关病理学的理论而具有较高的准确性,但操作的繁琐而使其作为检测技术的实用性不佳[25-27]。此外,利用其它免疫学技术或不同免疫学技术的组合也有探索,但资料的系统性和实用性相对不强[128]
 
3 分析与展望
免疫学检测技术的应用已经非常广泛,ELISAdot-IGSS的应用更为普遍。从病原学、病理学和流行病学研究领域而言,免疫学检测技术无疑是一类十分有效而常用的技术手段。
已有蚕病诊断与检测技术研究和现在免疫学技术的发展相比,随着商品化标记抗体等试剂盒的发展、自动化酶标仪和金标试纸条的制作等的发展,蚕病诊断与检测技术在灵敏度、特异性和简易化等技术性问题方面还有许多可以得到提高。
从病害控制的角度而言,作为病害诊断与检测的根本性目的是为诊断与检测后,采取正确的技术措施(治疗、用药和扑杀等)提供科学依据。从现有的养蚕防病技术而言,蚕病诊断或检测后尚无何种针对性的有效措施或可启动的有效治疗程序。家蚕高密度的饲养方式(极易发生个体间的病害传播)、较短的生命周期(幼虫期)和对病原微生物较低等的防御能力(用药困难)等特点,决定了养蚕的病害控制主要以预防为主,与医学或兽医学病害诊断与检测的目的和要求存在较大的不同。在后续技术措施问题没有得到较好解决的前提下,诊断和检测的成本和简易化程度等问题的重要性显然是更为其次的问题。
在养蚕期间家蚕微粒子病的诊断与检测与上述其它蚕病的情况类似,但作为生产无Nb感染蚕种的检疫技术而言,有其特殊的价值和意义。在家蚕微粒子病的检测中,同样需要解决灵敏度和特异性的问题。在已有研究中灵敏度虽然ELISA法可达到103孢子/mL的水平[20-23],但该法由于抗体捕获孢子的能力较弱(尤其是单抗)等问题的存在,灵敏度的稳定性较差。在特异性方面,免疫学检测技术虽然能鉴别不同的微孢子虫[81621-2224],但这些结果均是在某一特定实验室微孢子虫浓度(并非任何浓度)下的鉴别能力,实际检测往往是针对未知浓度样本而进行。在所获单抗针对微孢子虫孢子的抗原决定簇特异性不明[29]和特定浓度下才可鉴别的现状下,实用化检测技术尚有待进一步深入研究。
在对Nb孢子的检测技术方面,ELISAdot-IGSS是相对值得研究和探索的技术。在ELISA技术中,解决Nb孢子个体和比重较大,包被或抗体捕获孢子效果不佳引起检测灵敏度不稳定的问题是其技术成熟的关键。而dot-IGSS技术中,特异性(异物干扰)和成本(规模化)等都是值得关注的问题。
 
 考 文 献
 
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