首页 家蚕病害诊断辅助系统 家蚕病害远程诊断 关注养蚕安全 家蚕病理学与病害控制研究室 养蚕札记 蚕丝业文化
 
当前位置:首页 > 关注养蚕安全
破碎法提取家蚕微孢子虫孢子核酸的PCR检测灵敏度试验
阅读次数:2809 [2012-03-20]
 
破碎法提取家蚕微孢子虫孢子核酸的PCR检测灵敏度试验
 
李光才1蔡顺风1 何祥康1 何欣怡1 马焕艳1 孟祥坤1   邱海洪1何永强2 鲁兴萌1
1浙江大学蚕蜂研究所,杭州 3100582浙江出入境检验检疫局技术中心,杭州 310012
 
摘 要 家蚕微粒子病检测技术是该病防治中的一项重要技术,本文在通过破碎法提高模板核酸获取量的基础上,对纯化家蚕微粒子虫孢子的 PCR检测灵敏度进行了测试。提取核酸-模板稀释测试12对引物的灵敏度中有4对引物达到0.05粒(102/mL)、4对引物5粒(104/mL)、1对引物50粒(105/mL)、2对引物500粒(106/mL)和1对引物5000粒(107/mL)。两对灵敏度较高的引物(NbZS004F/ NbZS004RNbZS007F/ NbZS007R)灵敏度临界值(0.05粒和0.005粒)的PCR重复检测率均为90%。纯化家蚕微粒子虫孢子稀释后提取核酸再进行PCR检测试验中,NbZS004F/ NbZS004RNbZS007F/ NbZS007R的灵敏度分别为:5粒(104/mL)和0.5粒(103/mL)。
关键词家蚕微粒子病;孢子;PCR;检测;灵敏度

中图分类号          文献标识码              文章编号

 

 

 
Study on the Detection Sensitivity of PCR Method for Silkworm Pebrine Diseases
 
Abstract Silkworm pebrine disease detection technology is an important technique in the prevention and treatment for pebrine. Based on the higher DNA recovery by acid-washed glass beads treatment, detection sensitivity of PCR method for purified Nosema bombycis sporeswas tested. In DNA extraction - template dilution test, sensitivity of 12 pairs of primers are as follows: 4 pairs of primers are 0.05 spore (102 spore/mL), 4 pairs of primers are 5 spores (104 spore/mL), 1 pair of primers is 50 spores (105 spore/mL), 2 pairs of primers are 500 spores (106 spore/mL), 1 pair of primers is 5000 spores (107 spore/mL). The repeatability of sensitivity thresholds of NbZS004F/ NbZS004R (0.05) and NbZS007F/ NbZS007R (0.005) was 90%. In spore dilution - DNA extraction test, detection sensitivity of NbZS004F / NbZS004R and NbZS007F / NbZS007R are 5 spores (104 spore/mL) and 0.5 spores (103 spore/mL), respectively.
 
Key words Silkworm Pebrine disease;Spore;PCR;Detection;Sensitivity
 
 
 


 

收稿日期2011--  接受日期2011--
资助项目:现代农业产业技术体系建设专项(No.CARS-22-ZJ0202),浙江省科技厅重大项目(No.2010C12005-2),国家质量监督检验检疫总局科研项目(2007IK017
作者简介:李光才(1986),男,浙江,硕士研究生。
          E-mail: tiyixuxian@163.com
通信作者鲁兴萌教授博士生导师。
Tel: 0571-88982305, E-mail: xmlu@zju.edu.cn
 
家蚕微粒子病的PCR检测技术是众多学者和技术管理部门十分关注和寄予期待的一项技术[1]。对于纯化的家蚕微粒子虫Nosema bombycis,简称Nb孢子的检测而言,PCR检测的灵敏度高于或远远高于光学显微镜检测,不是一件难于理解的事情。但作为一种实用化的检测技术,PCR检测技术与光学显微镜检测技术一样,涉及实用环境条件下的灵敏度、特异性、成本和工效等问题。本研究根据前人有关PCR检测家蚕微粒子病的研究[1]、NCBI发表的有关数据、家蚕微粒子病的病理学和检疫的要求[2]等,采用破碎法[3]提取家蚕微粒子虫孢子核酸,试图通过提高核酸模板量,提高PCR检测的实验室检测灵敏度,并测试了“提取核酸-模板稀释”和“孢子稀释-提取核酸”两种形式的不同引物PCR扩增灵敏度,现报道如下:
 
1材料和方法
1.1材料及主要试剂
家蚕微孢子虫由浙江大学蚕蜂研究所家蚕病理学与病害控制技术实验室继代保存。
1.2 家蚕微孢子虫的繁殖和纯化
纯化的Nb孢子用生理盐水调制成106孢子/mL的浓度,取镊子用脱脂棉沾取,均匀涂布于桑叶背面,饲喂5龄起蚕,待全部食完,用普通桑叶常规饲养至化蛾。收集蛾子自然风干,常温保存。Percoll离心法[4] 纯化收集Nb孢子。
1.3 破碎法提取家蚕微孢子虫DNA
取0. 5mL Nb孢子液于破碎管中,加0.5 mL DNA提取缓冲液、0.6 g混合珠(玻璃珠:陶瓷珠=3:1)和0.1 mL 10% SDS,于Precellys24(Bertin Technologies)多功能样本研磨均质器6500 r/min破碎3 min后,再加5 μL 蛋白酶K,55℃水浴2 h,常规酚/氯仿法抽提DNA(加入等体积的饱和酚,颠倒充分混匀5 min412000 r/min离心10 min;取水相加等体积的酚:氯仿:异戊醇[25:24:1],颠倒充分混匀5 min412000 r/min离心10 min;取水相加等体积氯仿:异戊醇[24:1],颠倒充分混匀5 min412000 r/min离心10 min;取水相加2.5倍体积的预冷[-20℃]的无水乙醇,0.1倍体积3 MNaAc [pH5.2]-20沉淀30 min12000 r/min离心10 min,去上清;沉淀用75%的乙醇漂洗,6000 r/min离心3 min,重复洗涤一次,吸干上清,自然风干,溶于100 μL TE [10 mM Tris1 mM EDTApH8.0],加入2 μL RNAase37保温30 min-20保存)用于PCR。109粒Nb孢子模板核酸提取液用于PCR(0.5 μL)的浓度相当于5×106粒。
1.4 PCR引物与检测
测定用引物有前人研究用引物和自主设计引物,参见文献[1]和表1[5~6]
PCR检测采用25 μL反应体系,其中含2.5 μL 的10×PCR缓冲液,2.0 μL 的dNTPs,0.5 μL引物,0.5 μL模板DNA,0.2 μL 的TaqDNA聚合酶,18.8 μL的dd H2O。PCR反应:94 ℃预变性5 min,94℃-30S、44℃-30s、72℃-1min,扩增32个循环,72℃延长10 min。
 
表1 家蚕微粒子病PCR检测引物
Tab.1 A list of PCR primers for Nosema bombycis spores inspection
引物
序列(5'-3')
碱基位置
靶基因
大小(bp)
 
NbZBF
NbZBR
ACTCTAAGATTAACCCAT
TGTATGCTACCTGAACA
/
N bombycis
AY259631
1489
朱勃,
2008
NbWYDF
NbWYDR
CACCAGGTTGATTCTGCCTGAC
GCAACCATGTTACGACTTATATCAGA
1-1204
N bombycis
SSU rRNA (JF443599.1)
1204
韦亚东等,2005
NbZS004F
NbZS004R
TGA TTC TGC CTG ACG
CGA TTT GCC CTC C
9-393
N bombycis
SSU rRNA (JF443599.1)
385
——
NbZS007F
NbZS007R
GTT GAT TCT GCC TGA C
CTC CGA TTT ATC TTG TA
7-384
N bombycis
SSU rRNA (EU864525.1)
378
——
NbPRO002F
NbPRO002R
GAT AAA GTA GCC ACA GG
CCA TCC GCA CCA A
121-602
N bombycis
Spore wall protein12
(EF683112.1)
482
——
NbPRO008F
NbPRO008R
CAA AGC GTT CGT AAT
GAG CAA ATA GCA CCA C
649-1133
N bombycis
Spore wall Protein 4
(EF683104.1)
485
——
 
1.5家蚕微孢子虫孢子模板DNA梯度稀释
破碎法提取109Nb孢子DNA,将模板DNA进行10倍阶段稀释(“提取核酸-模板稀释”)后进行PCR。对检测灵敏度较高的两对引物的最低检测灵敏度进行10次重复检测。

VIF/530R

 
NBEF35F/NBEF957R
1.6家蚕微孢子虫孢子液的梯度稀释和核酸提取

 

将109粒/mL的Nb孢子液进行10倍阶段稀释后按照“1.3”的方法抽提核酸模板“孢子稀释-提取核酸”,再进行PCR检测。
 
2结果
2. 1家蚕微孢子虫孢子模板DNA梯度稀释PCR检测
对前人曾研究用引物和自主设计引物(KAI01/KAI02#1/#2V1F/530RNb5/Nb3NBEF35F/ NBEF957RNbZBF/NbZBRMP1/MP2NbWYDF/NbWYDRNbZS004F/NbZS004RNbZS007F/ NbZS007RNbPRO002F/NbPRO002RNbPRO008F/NbPRO008R进行的不同Nb孢子模板梯度稀释(“提取核酸-模板稀释”)PCR检测的每孔(样)最低检出孢子数分别为:50粒、500粒、0.05粒、500粒、5粒、5000粒、5粒、5粒、0.05粒、0.05粒、5粒和0.05粒(图1)。
根据Nb的SSU rRNA(FJ854546.1JF443599.1EU864525.1)和孢壁蛋白(EF683104.1)为靶基因设计的引物在本试验中的检测灵敏度最高(0.05粒),但根据Nb的ITS和SSU rRNA等(AY259631)设计的引物在本试验中的检测灵敏度最低(5000粒)。
 
2. 2 NbZS004F/NbZS004RNbZS007F/NbZS007R两对引物的PCR重复检测试验
从“2.1”检测结果中选择NbZS004F/ NbZS004RNbZS007F/ NbZS007R两对检测灵敏度较高的引物,在其检测临界浓度(分别为:108倍和109倍稀释)进行重演试验的结果显示均为90%,也即其中的NbZS007F/ NbZS007R更为清晰和更为灵敏(图2)。

KAI01 / KAI02

 
#1 / #2
Nb5 / Nb3
VIF / 530R
NBEF35F / NBEF957R
NbZBF / NbZBR
MP1 / MP2
NbWYDF / NbWYDR
NbZS007F / NbZS007R
NbZS004F / NbZS004R
NbPRO002F / NbPRO002R
NbPRO008F / NbPRO008R
 

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

图1不同引物和家蚕微孢子虫孢子模板DNA稀释度的PCR检测
Fig.1 PCR inspection of DNA from Nosema bombycis spores
with different priemers and ten times the gradient dilution
注:MDL2000 DNA分子量标记,自上而下分别为20001000750500250100;图片上端数字代表10倍梯度稀释的倍数,“1”为稀释10倍、“8”为稀释108倍,换算成Nb孢子数即每孔(样)分别为500000粒和0.05粒。
 
 
 
图2 NbZS004和NbZS007两对引物的重演试验
Fig.2 PCR inspection with primers of NbZS004 F/R and NbZS007F/R for repeat tests
注:MDL2000 DNA分子量标记,自上而下分别为20001000750500250100;图片上端数字分别代表稀释Nb孢子核酸模板提取液108倍稀释和109倍稀释后NbZS004 F/RNbZS007F/R10个重复样本。
2. 3家蚕微孢子虫孢子梯度稀释后提取DNA模板的PCR检测
Nb孢子10倍梯度稀释后提取DNA模板(“孢子稀释-提取核酸”),用NbZS004F/ NbZS004RNbZS007F/ NbZS007R两对检测灵敏度较高的引物进行的PCR的检测灵敏度如图3所示,分别为5粒和0.5粒。也就是按单位体积Nb孢子数的检测灵敏度而言,Nb孢子稀释后提核酸模板较高浓度Nb孢子抽提核酸后再稀释DNA模板(“提取核酸-模板稀释”)的检测灵敏度略低。
 
 
 
图3不同梯度稀释家蚕微孢子虫孢子模板DNA的PCR检测
Fig.3 PCR inspection of DNA for different gradient dilution of Nosema bombycis spores
with NbZS004 F/R and NbZS007F/R
注:MDL2000 DNA分子量标记,自上而下分别为20001000750500250100;图片上端数字分别代表稀释Nb孢子的稀释倍数,1为原液(109粒)、8108倍稀释(100粒);左为NbZS004 F/R,右为NbZS007F/R
 
3讨论
高浓度(2×109/mLNb孢子“提取核酸-模板稀释”的灵敏度比较试验中,本实验室自行设计的4对引物(NbZS004F/NbZS004RNbZS007F/ NbZS007RNbPRO002F/NbPRO002RNbPRO008F/ NbPRO008R)和前人研究的4对引物(V1F/530R[7]NBEF35F/NBEF957R[8]MP1/MP2[9] NbWYDF/NbWYDR[6])分别为:0.05粒(102粒/mL)、0.05粒(102粒/mL)、5粒(104粒/mL)、0.05粒(102粒/mL)、0.05粒(102粒/mL)、5粒(104粒/mL)、5粒(104粒/mL)和5粒(104粒/mL),均高于已发表3×104/mL的灵敏度[9],这种灵敏度的提高可能与DNA模板的获取量增加有关[39]。而低于1粒孢子的结果则可能与Nb孢子靶基因的拷贝数、孢子计数和梯度稀释的定量分析能力不足等有关。但KAI01/KAI02[10]#1/#2[7]Nb5/Nb3[11]NbZBF/NbZBR[5]的检测灵敏度分别为:50(105粒/mL)500(106粒/mL)500(106粒/mL)5000(107粒/mL)粒,低于3×104/mL的灵敏度[9],也低于1×104/mL的光镜检测工作灵敏度
“孢子稀释-提取核酸”的形式较“提取核酸-模板稀释”更接近与实际应用的灵敏度,两对在“提取核酸-模板稀释”试验中灵敏度较高的引物(NbZS004F/NbZS004RNbZS007F/ NbZS007R)在该形式中,其灵敏度略有下降(5粒和0.5粒,104粒/mL和103粒/mL),但仍高于3×104/mL的灵敏度。
已有PCR法检测Nb孢子的研究表明用于蛾或卵等生物体材料时,其检测灵敏度较纯化Nb孢子下降约103,也就是Nb的核酸模板获取量大幅下降或影响PCR反应的因子大量增加,该问题也是阻碍PCR检测技术应用于实际的主要技术性屏障。破碎法是否能有效提高从蛾或卵等生物体材料中的Nb核酸模板获取量?提高多少?或影响PCR反应的因子有多少?等一系列问题都是其实用化过程中有待进一步研究的问题。
 
参考文献(references)
[1] 鲁兴萌,李光才,孟祥坤,等. 家蚕微粒子病的PCR检测技术研究与应用[J]. 蚕业科学,2011375:878~882
[2] 浙江大学主编.家蚕病理学[M]. 北京: 中国农业出版社,2001:148~172
[3] 蔡顺风,何欣怡,何祥康,等. 一种快速高效制备家蚕微孢子虫基因组DNA和总蛋白的方法[J]. 蚕业科学,2011375:印刷中
[4] 黄少康,鲁兴萌. 家蚕微粒子虫(Nosema bombycis)与其形态变异株的侵染性及孢子表面蛋白的比较研究[J]. 中国农业科学,200437111682-1687
[5] 朱勃. 微孢子虫的起源与进化及PCR快速检测家蚕微粒子病[D]. 硕士学位论文.
[6] 韦亚东,张国政,陆长德. 家蚕微孢子虫原位杂交诊断技术研究[J]. 蚕业科学,2005311: 64-67
[7] 陈秀,黄可威,沈中元,等. 家蚕微粒子病的PCR诊断技术研究[J]. 蚕业科学,1996223: 231-234
[8] HatakeyamaYHayasake S. Specific detection and amplification of microsporidia DNA fragments using multiprimer PCR[J]. Sericulture Science Japanese. 200236: 97-102
[9] 刘吉平,曹阳,Smith J.E.,等. 模拟感染家蚕微粒子病的PCR分子诊断技术研究[J]. 中国农业科学,200437: 1925-1931
[10] Kawakami YInoue TUchida Yet al. Specific amplification of DNA from reference strains of Nosema bombycis[J]. Sericulture Science Japanese1995642):165-172
[11] 潘中华,贡成良,郑小坚,等. 家蚕微孢子虫DNAPCR检测灵敏度研究[J]. 常熟理工学院学报(自然科学版),200721: 51-54